基于細胞的體外預測模型可能支持國際上開發新疫苗和其他治療肺相關疾病（如 COVID-19、慢性阻塞性肺病或特發性肺纖維化）的努力。將3D生物制造與氣液界面培養相結合，可以對組織模型進行工程改造，從而在體外重現健康和患病狀態下呼吸道的典型特征。這些模型不僅提供了深入了解病毒與靶位點宿主細胞相互作用的潛在機制的機會，而且還有助于減少未來研究中使用的動物數 量，從而支持 3Rs（替換、減少和細化）原則。在這項研究中，我們描述了 3D?生物制造氣道上皮模型的生成及其生理相關性的評估。該模型的特點是血管緊張素轉換酶 2(ACE2)?的表達，ACE2 是冠狀病毒內化所需的一種蛋白質。 ACE2蛋白定位于頂膜表明上皮細胞是極化的，粘蛋白5AC蛋白的存在表明該模型可以產生氣道表面液體，這是氣道上皮細胞的一種生理功能。因此，這些生物工程組織模型可用于開發不同的療法和疫苗。
2019年底出現的新型冠狀病毒病（COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的。 該病毒具有高度傳播性，并使用血管緊張素轉換酶 2 (ACE2) 作為主要受體進入哺乳動物細胞。ACE2 是一種細胞表面蛋白，存在于許多細胞和組織中，包括肺、心臟、血管、腎臟、肝臟和胃腸道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺組織中適度表達，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血壓等病理狀況中高度表達 (Saheb Sharif-Askari, 2020)。 眾所周知，SARS-CoV-2 會感染呼吸道并傳播到整個人體，導致多器官感染癥狀（de Melo，2021 年）。 因此，由于病毒對人類健康的嚴重影響，開發新的診斷方法、疫苗和抗病毒藥物迫在眉睫。
圖 1.?(A)?使用 CAMotics?的 3D?生物打印模型圖示，俯視圖（左）和側視圖（右）。 (B)?3D?生物打印肺組織模型轉移到 Transwell?插入物。
體外模型對于了解疾病機制以及在臨床試驗前驗證治療方法至關重要。 盡管目前的 2D 培養模型在篩選病毒復制、感染和藥物篩選方面很常見，但它們無法概括組織的復雜性和生理學。 然而，像 3D 生物打印技術這樣的新平臺可以生成在分子組成、生物力學和復雜性方面更類似于原位組織的組織模型（Singh，2020；Seyfoori，2021）。 這些 3D 生物打印模型可以更好地了解類似于人體器官的微環境中潛在的宿主-病原體相互作用，從而有助于篩選針對肺部疾病（如COVID-19）的藥物。
在這項研究中，我們專注于生物打印原代人支氣管上皮細胞或 Calu-3 細胞以生成氣液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一種分化良好且具有特征的細胞系，來源于人支氣管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。 人肺的黏膜下腺是氣道表面液體、粘蛋白和其他免疫活性物質的主要來源。
生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培養 14 天，并對 ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白進行免疫染色。 使用本應用說明中介紹的實驗裝置，可以研究宿主-病原體與 SARS-CoV-2 和氣道上皮細胞的相互作用（Zhu，2010）。
圖 2.?第 7?天 (D7)?和第 14?天 (D14)?肺組織模型在 10?倍放大時的 H&E?染色。 位于構建體頂部的 Calu-3?和 HBE?細胞的上皮層。 比例尺=100 μm。
在肺組織模型中使用了兩種不同的上皮細胞類型：人支氣管上皮細胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌細胞衍生的上皮細胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纖維細胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持細胞。 在根據各自制造商的協議進行生物打印之前，將細胞解凍并在 2D 中擴增。 HBEpC在氣道上皮細胞生長培養基（C-21060，PromoCell）中培養，HPF在補充有生長培養基2試劑盒（C-23020，PromoCell）的成纖維細胞生長培養基2中培養，分別用于第4代和第9代； 而 Calu-3 細胞在補充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-鏈霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。
肺模型被設計成一個圓盤，底部有一個實心層，頂部有一個 5 層邊緣（圖 1A、1B）。 這樣做是為了促進接種后上皮細胞的包埋。 該磁盤是用 GelMA-Laminin?521?(GelMA-LN521,?CELLINK)?3D 打印的。 接下來，將 2?x 106?HPF 用胰蛋白酶消化、洗滌、收集、旋轉并輕輕重懸于 100?μL 成纖維細胞培養基 2?中，然后將其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，預熱至37°C并轉移到琥珀色墨盒中（?CSO010311502，CELLINK）。 為了去除截留的氣泡，將嵌入 HPF?的 GelMA-LN521?濾芯以 460g 離心 1?分鐘。 在開始打印會話之前，將墨盒安裝在 BIO?X? 生物打印機中設置為 27°C 的溫控打印頭（00000020346，CELLINK）中 20 分鐘。 將藥筒倒置 2 至 3 次以避免細胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合適生物打印溫度為 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用溫控打印頭在 27°C 下對圓盤籃進行生物打印。 首先使用 405 nm 光固化模塊（距離設置為 5 厘米）對每個構建體光固化 12 個圓盤復制品，并將成纖維細胞生長培養基添加到每個孔中。 然后在添加上皮層之前，將圓片在成纖維細胞生長培養基中于 37°C 孵育 3 天。
圖 3. HBE?細胞中 ACE2?的免疫染色。 在 ALI?培養的構建體上不同天的 ACE2（綠色）和細胞核染色 DAPI（藍色）。 比例尺=100 μm。
對于上皮層，將?HBE?或?Calu-3?細胞分別重懸于氣道上皮生長培養基或?MEM?完全培養基中，并補 3充 5 ug/mL LN521。將 150K 細胞/cm2 接種在每個圓盤的頂部。從孔中取出成纖維細胞培養基，將5 x 105 個細胞重新懸浮在 360 μL 的完全培養基中，并在每個圓盤的頂部添加 30 μL 的細胞懸浮混合物。接種后將構建體留在工作臺上 10 分鐘，然后轉移到培養箱中再放置 20 分鐘以使細胞附著在生物打印盤上。將 HBE 構建體以 1:9 的比例輕輕浸入成纖維細胞和氣道上皮培養基的混合物中；將 Calu-3 構建體以 1:9 的比例浸入成纖維細胞和 MEM 培養基的混合物中。浸沒培養物在37°C、5% CO2 下生長 4 天，然后轉移至 ALI 培養物。 ALI 培養是通過將結構轉移到 Transwell 插入物中來建立的，該插入物補充了適當體積的相同介質，如上所述（圖 1B）。培養基每 2 至 3 天更新一次。
圖 4.?Calu-3?細胞中 ACE2?的免疫染色。 細胞在 ALI?培養物中的 GelMA-LN521?上生長。 在第 7?天 (D7) 和第 14?天 (D14)，對細胞進行固定、切片和 ACE2?染色（綠色）。 使用 DAPI（藍色）可視化細胞核。 構建體在明場中可視化以查看 ALI。 比例尺 = 100?μm。
根據 CELLINK 的固定方案，在第 7 天和第 14 天（ALI 培養）收集樣本，并在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定進行組織學染色。 然后將樣品包埋在石蠟中，按照 CELLINK 的切片協議，使用切片機獲得10 μm 切片。 按照 CELLINK 的免疫熒光方案并使用 Alexa Fluor 488（A-11029，Thermo Fisher Scientific）作為二抗，對切片進行 ACE2（MAB933，R&D Systems）和 MUC5AC（AB3649，Abcam）染色。 樣品也按照 CELLINK 的方案進行了 H&E 染色。 所有協議都可以在 CELLINK 網站的 Support 選項卡下找到。
圖 5. HBE?細胞中粘蛋白的免疫染色。 細胞在 ALI?培養物中的 GelMA-LN521?上生長。 在第 7?天 (D7)?和第 14?天(D14)，細胞被固定、切片并染色 MUC5AC（紅色）。 使用 DAPI（藍色）可視化細胞核。 構建體在明場中可視化以查看ALI。 比例尺 = 100 μm。
用于生成肺組織模型的制造方法創建了一個完整且堅固的構造，在整個實驗過程中保持其形狀。 樣品橫截面的H&E 染色顯示，接種在構建體頂部的 Calu-3 和 HBE 細胞在第 7 天形成了緊密的單層。然而，在第 14天，Calu-3 細胞形成了厚的多層上皮樣 結構，而 HBE 細胞仍然保持薄的單層（圖 2）。 這表明初級支氣管上皮細胞保持了接觸抑制，這種抑制在癌細胞中丟失，導致細胞相互重疊生長。
圖 6.?Calu-3?細胞中粘蛋白的免疫染色。 細胞在 ALI?培養物中的 GelMA-LN521?上生長。 在第 7?天 (D7)?和第 14 天 (D14)，細胞被固定、切片并染色 MUC5AC（紅色）。 使用 DAPI（藍色）可視化細胞核。 構建體在明場中可視化以查看 ALI。 比例尺 = 100?μm。
接下來，我們對 ACE2 進行了免疫染色，ACE2 是一種參與冠狀病毒內化的細胞表面蛋白。在 HBE 樣本中，在第 7 天單層中很少有細胞對 ACE2 進行染色，而在第 14 天，在許多細胞中檢測到 ACE2 染色（圖 3）。與HBE 不同，Calu-3 樣本中的大多數細胞在第 7 天和第 14 天都對 ACE2 進行了染色（圖 4）。此外，在頂端膜域（ALI 培養中的空氣表面）觀察到 ACE2 的免疫染色，如在第 14 天樣品中朝向頂部 Calu-3 細胞的局部綠色信號所見（圖 4），表明細胞層是極化的。這些數據一起表明，我們的 Transwell 模型顯示了極化的氣道上皮細胞，在原代細胞和癌癥衍生細胞中都表達了 ACE2。
為了進一步表征模型，我們對 ALI 培養結構中的粘蛋白進行了免疫染色，因為據報道 MUC5AC 是由氣管支氣管表面上皮中的杯狀細胞產生的 (Kesimer, 2009)。我們在 ALI 培養模型中觀察到 MUC5AC 在 HBE 和 Calu- 3 細胞中的表達（圖 5、6），表明細胞已經分化。我們的數據共同表明，這里介紹的 3D 生物制造模型將為設計 3D 肺組織模型提供一個極好的工具，以快速篩選針對 COVID-19 的生物制劑。這也將有助于減少動物研究，從而支持 3R 原則。
該研究表明，3D 生物打印與 Transwell 細胞培養相結合可用于生成復雜的體外肺上皮模型。
* 體外 ALI 模型顯示 ACE2 和 MUC5AC 蛋白的表達。
* 原代支氣管上皮細胞在整個實驗過程中保持緊密的單層，而 Calu-3 細胞在第 14 天形成多層上皮。
* 與腺癌細胞來源的 Calu-3 細胞系相比，ACE2 在原發性支氣管上皮細胞中的表達中等。
* ALI 培養中生長的細胞變得極化，如培養物頂膜上 ACE2 的表達所見。
functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. The Journal of Pathology. 2004; 203(2): 631–637. DOI:10.1002/path.1570.
(3D) in vitro tissue models in fighting against COVID-19. Biomaterials Science. 2021; 9(4): 1217–1226. DOI:10.1039/D0BM01616K.
