與傳統(tǒng)的2D?細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，3D?細(xì)胞球體提供了更多的仿生微環(huán)境，?在許多組織工程應(yīng)用中已被證明是有價(jià)值的。盡管3D?細(xì)胞培養(yǎng)具有受益??效應(yīng)，但目前球體形成方法的可擴(kuò)展性有限，對(duì)球體組織工程的臨床翻譯?提出了挑戰(zhàn)。雖然最近采用的液滴微流體可以提供一個(gè)連續(xù)的生產(chǎn)過(guò)程，?但使用油和表面活性劑，通常低通量，以及額外的生物制造步驟的要求阻?礙了球體培養(yǎng)的臨床翻譯。在這里，使用清潔(例如，無(wú)油和無(wú)表面活性??劑)?，超高通量(例如，8.5?mL?min-1,10000個(gè)球體 s-1)?，單步空氣微流控??生物制造球體形成區(qū)室化水凝膠。這種新技術(shù)可以可靠地生產(chǎn)一維纖維，?二維平面和三維體積劃分的水凝膠構(gòu)造，其中每一個(gè)都允許空心球形成隔?室的明顯(一)各向同性取向。在噴墨生物打印分區(qū)水凝膠中產(chǎn)生的球體在?成軟骨行為方面優(yōu)于2D?細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，細(xì)胞球體可以從劃分的水凝??膠中獲得，并用于以自下而上的方式構(gòu)建形狀穩(wěn)定的厘米大小的無(wú)生物材?料的活組織。因此，預(yù)計(jì)在空氣中微流體生產(chǎn)的球形分區(qū)水凝膠可以促進(jìn)?生產(chǎn)和使用的細(xì)胞球體的各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
2D?體外細(xì)胞培養(yǎng)歷來(lái)是組織工程領(lǐng)域的??黃金標(biāo)準(zhǔn)，其目的是修復(fù)、再生或替換受?損的活組織。然而，傳統(tǒng)的2D?細(xì)胞培養(yǎng)??環(huán)境不像它們?cè)隗w內(nèi)的天然對(duì)應(yīng)物，因此?對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生不利影響。3D?細(xì)胞培養(yǎng)??,?如細(xì)胞球體或類器官已經(jīng)允許一種更加?仿生的方法來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。[6-8]已經(jīng)廣?泛報(bào)道，仿生3D?球體培養(yǎng)的細(xì)胞在用于??組織工程時(shí)優(yōu)于2D?培養(yǎng)的細(xì)胞[9-13]?，并且可以促進(jìn)更可靠的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，并?使得具有改進(jìn)功能的宏觀組織構(gòu)建體的工?程。例如，載有干細(xì)胞球體的生物墨水的?3D?打印改善了生物制品構(gòu)建體的功能行??為(例如，成軟骨分化和軟骨基質(zhì)沉積)?。?雖然有希望，但是諸如球體培養(yǎng)等3D?培??養(yǎng)技術(shù)的生產(chǎn)方法阻礙了它們的臨床翻譯?,?這些生產(chǎn)方法通常是批處理過(guò)程，擁有?屬性較低。
這些批量生產(chǎn)技術(shù)如微孔[9,10,12,21-24]和懸掛滴[13,2?5-27]需要多個(gè)復(fù)雜和耗時(shí)的步驟，只能提供有限的球體產(chǎn)量?。盡管特定的生物反應(yīng)器方法可以提高產(chǎn)量，但它們?nèi)匀痪??限于批處理過(guò)程，與微電池和懸掛液滴等隔離技術(shù)相比，這??些批處理過(guò)程通常對(duì)球體直徑的控制水平較低。?[28]雖然這??可能足以進(jìn)行小型實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，但仍然需要具有高生??產(chǎn)率和高單分散性的強(qiáng)大的單步生物制造技術(shù)來(lái)促進(jìn)臨床尺??寸組織的球體技術(shù)的臨床翻譯。?[29,30]微流體防火分區(qū)最近被研究用于將球體生產(chǎn)從批量生產(chǎn)過(guò)?程發(fā)展為連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程。在中空生物材料隔室中的細(xì)胞微流??體封裝允許細(xì)胞球形成微生物反應(yīng)器的控制連續(xù)生產(chǎn)，這提??供了比傳統(tǒng)的批處理工藝更高的生產(chǎn)率。?[31-3提供了比傳統(tǒng)?的批處理工藝更高的生產(chǎn)率。?[31-39]
然而，?由于各種原因，傳統(tǒng)的片上微流控液滴發(fā)生器的設(shè)計(jì)阻?礙了微流控液滴產(chǎn)生的球體在臨床上的廣泛應(yīng)用。首先，傳統(tǒng)?的芯片上微流體需要使用不可混溶的液體來(lái)形成液滴，這通常?需要使用已知具有潛在危害并且常常與臨床應(yīng)用不相容的油和?表面活性劑。因此，產(chǎn)生的球體形成隔室需要大量清洗，?以試?圖在培養(yǎng)/使用之前除去油和表面活性劑，這與耗時(shí)的手工過(guò) ?程有關(guān)，這對(duì)細(xì)胞活力有不利影響。[45,46]其次，雖然傳統(tǒng)的?芯片上微流體允許連續(xù)的球體生產(chǎn)，但液滴形成通常僅限于滴?水狀態(tài)，導(dǎo)致低吞吐量(<?10μLmin-1) ?，這對(duì)于大多數(shù)臨床應(yīng)??用仍然不足。最后，從它們的隔室中回收球體以進(jìn)行進(jìn)一步的?生物制造加工通常需要一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，這可能對(duì)細(xì)胞?存活產(chǎn)生不利影響。因此，仍然需要一種清潔、快速、細(xì)胞友?好和單步生物制造策略，使大型工程組織具有原位球化形成特?性。
在這里，我們介紹了一種新的空氣微流體(IAMF)[48]為基 ?礎(chǔ)的生物打印技術(shù)，克服了球體使用的翻譯限制。具體來(lái)說(shuō)，?IAMF?實(shí)現(xiàn)了包含無(wú)生物材料細(xì)胞的隔室的生物物質(zhì)工程，這??些隔室起到了球體形成微反應(yīng)器的作用。有利的是，這種創(chuàng)新?方法代表了用于以臨床相關(guān)速率(1-8.5 mL?min-1相當(dāng)于10000??個(gè)球體 s-1)產(chǎn)生高密度細(xì)胞球體的臨床尺寸水凝膠的工程的單?步生物制造技術(shù)。生產(chǎn)能力的顯著提高是由于 IAMF?能夠單分?散地賦予噴墨生物印刷油墨在噴射狀態(tài)下具有中空隔室，而傳?統(tǒng)的芯片上方法僅限于更慢的滴水狀態(tài)。這種新型的生物制造?過(guò)程也是非常清潔的，因?yàn)?IAMF?消除了傳統(tǒng)上對(duì)油，表面活?性劑或犧牲模板的需要，?以在工程組織內(nèi)創(chuàng)建空心隔室。除了?傳統(tǒng)的基于機(jī)器的噴墨生物打印之外，我們證明我們的內(nèi)聯(lián)自?下而上的生物制造也可以以簡(jiǎn)單的手持設(shè)備的形式使用，?以手?動(dòng)打印具有多種復(fù)雜性的球體形成的分隔水凝膠，這進(jìn)一步促?進(jìn)了該技術(shù)與臨床應(yīng)用的兼容性。雖然微型組織的大規(guī)模生產(chǎn)?的翻譯挑戰(zhàn)對(duì)于過(guò)多的不同組織類型是重要的[28] ，但我們??產(chǎn)生了臨床大小的軟骨組織作為模型組織，同時(shí)承認(rèn)使用這種?方法也可以產(chǎn)生廣泛的其他(器官)形狀。
2.1. 空氣微流體技術(shù)在分區(qū)水凝膠生物制備中的應(yīng)用
IAMF?是一種微流體方法，通過(guò)在空氣中將液體射流與由壓電?驅(qū)動(dòng)的液體射流產(chǎn)生的恒定周期的水滴流碰撞，使得能夠以超?高吞吐量產(chǎn)生無(wú)芯片、無(wú)油和細(xì)胞相容的單分散微粒。?[48]
在這項(xiàng)研究中，我們將 IAMF?與噴墨生物打印相結(jié)合，?以允??許空氣中形成的中空微膠囊的控制合并，從而能夠生產(chǎn)大規(guī)模?的區(qū)室化水凝膠。為此，將兩個(gè)微噴嘴設(shè)置與可移動(dòng)的?XYZ收集工作臺(tái)結(jié)合使用(圖1a)。
為了形成中空微膠囊，含有氯化鈣(CaCl?2)的核心微噴溶液??與通過(guò)使用壓電驅(qū)動(dòng)將振動(dòng)疊加到微噴嘴上而產(chǎn)生的受控液滴?系統(tǒng)相撞(圖1b)。具有降低表面張力(jcore??>?jalgate)的海藻酸??鹽前體微噴的 Dropjet?聚結(jié)允許 Marangoni?驅(qū)動(dòng)的封裝(圖1c)??。這種封裝過(guò)程發(fā)生在 je?something?(iμD4/阝j2)1/3的時(shí)間尺???度上，i，D?，μ?和 j 分別表示微噴密度，直徑，粘度和表面張?力，通常在幾毫秒內(nèi)。這使得在收集液滴之前的10-100毫秒的??液滴飛行時(shí)間內(nèi)可以完全封裝。這使得能夠生產(chǎn)含有 CaCl2?核?心和海藻酸鹽前體外殼的雙層液滴。由此產(chǎn)生的核殼(即海藻???酸鈣)化合物液滴通過(guò)從核心層向海藻酸鹽層擴(kuò)散的 CaCl2??以內(nèi)?向外的方式交聯(lián)(圖1d)。由于離子海藻酸鹽交聯(lián)發(fā)生在毫秒范??圍內(nèi)[50] ?，并且由于交聯(lián)的內(nèi)向外性質(zhì)，當(dāng)復(fù)合液滴仍然在空?氣中時(shí)，?內(nèi)部海藻酸鹽層交聯(lián)，而外部海藻酸鹽層通過(guò) Ca2??+??離子的內(nèi)向擴(kuò)散隨時(shí)間發(fā)生交聯(lián)。然后通過(guò)可移動(dòng)的XYZ?收集器或微噴臺(tái)以控制的方式收集部分交聯(lián)的微膠囊。
值得注意的是，撞擊的時(shí)刻是定時(shí)的，使得空氣形成的微??囊的交聯(lián)仍然在進(jìn)行中，使得它們?cè)谥憰r(shí)立即與微囊進(jìn)行物?理接觸，從而有效地形成包含空心微隔室的瞬時(shí)固體3D?構(gòu)建??體(圖1e)。
我們假設(shè)通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的基于液滴的生物制造方法調(diào)整微??膠囊放置，可以以強(qiáng)大的，可預(yù)測(cè)的和可控的方式形成1D 纖??維，2D 平面和3D 體積的分區(qū)水凝膠(圖1f)。使用手持生物打?印裝置(圖1g，h)證明了這種生物制造方法，其允許使用形狀??穩(wěn)定的區(qū)室化水凝膠手動(dòng)直接填充缺陷(圖1i-k)。該手持方法?預(yù)計(jì)將促進(jìn)臨床應(yīng)用，如在外科手術(shù)過(guò)程中的原位生物打印。?此外，我們證明了這種新型的生物制造方法也可以與可編程3D生物打印機(jī)(圖11，m)相結(jié)合，我們證明了允許生產(chǎn)由更復(fù)雜?的幾何形狀組成的大規(guī)模結(jié)構(gòu)，如形狀穩(wěn)定的管狀分區(qū)水凝膠?(圖1n，o 和電影 S1，支持信息)。IAMF?的超高通量性質(zhì)(高??達(dá)8.5 mL?min-1)(圖 S1，支持信息)允許以快速，直接和單步?方式生物制造臨床尺寸的分區(qū)水凝膠(圖1p，q)。
由于 IAMF?產(chǎn)生的液滴的超高吞吐量和短的空中飛行時(shí)間，通?常需要快速(毫秒)交聯(lián)策略，如所提出的海藻酸鹽離子交聯(lián)或?光聚合。然而，依賴于較慢(幾秒鐘)交聯(lián)機(jī)制的材料，如絲素?蛋白，仍然可以利用海藻酸鈉作為犧牲結(jié)構(gòu)互穿網(wǎng)絡(luò)模板。
圖 1.?高度分隔水凝膠的空氣微流體生物制造。 ,a?）使用空氣微流體方法中的兩個(gè)噴嘴的分區(qū)水凝膠生產(chǎn)過(guò)程的示意圖。 ,b)?空氣中液滴形成??和液滴/隔室封裝的顯微照片。 ,c)?表面張力馬蘭戈尼流能夠通過(guò)水凝膠前體溶液封裝核心液滴。 ,d)?CaCl2從兩層全水液滴內(nèi)部向藻酸鹽層擴(kuò)??散，實(shí)現(xiàn)由內(nèi)而外的離子交聯(lián)機(jī)制，導(dǎo)致在兩個(gè)液滴層之間的界面處交聯(lián)藻酸鹽，而殼中的交聯(lián)仍然存在,正在進(jìn)行中。 ,e)?利用微室外殼在受?到?jīng)_擊時(shí)的持續(xù)交聯(lián)來(lái)設(shè)計(jì)固體多室水凝膠。 ,f)??隔室的受控沉積允許 1D?纖維、2D?平面和 3D?體積的隔室水凝膠。 ,g)?示意圖和 h)?具有集??成空氣微流體裝置的 3D?打印機(jī)的照片。 ,i)?使用 3D?打印機(jī)打印的空心管狀分隔水凝膠結(jié)構(gòu)的照片，j)?通過(guò)包含葡聚糖-FITC（綠色）和葡聚?糖-TRITC（紅色）染色溶液觀察到不滲漏。 ,k)?用于對(duì)隔室水凝膠生物墨水進(jìn)行手動(dòng)噴墨生物打印的手持式IAMF設(shè)備示意圖。 ,l)?用于直接填??充塑料模具缺陷的手持式 IAMF?設(shè)備的照片。,通過(guò)手持式噴墨生物打印，模具 m)?之前和 n)?之后的熒光照片，o)?被證明形狀穩(wěn)定，即使從模具中取出后，也被證明形狀穩(wěn)定。 ,p）?以 8.5 ?mL??min-1 ?的生產(chǎn)率生產(chǎn)的隔室熒光水凝膠的照片，能夠在 35?秒內(nèi)填充1.5×?1.5×?1.5?cmmmold?。 ,q)共焦熒光顯微鏡證實(shí)了隔室化水凝膠的形成，其中藻酸鹽用葡聚糖-FITC染成綠色，?中空核心用葡聚糖-TRITC染成紅色。
2.2. 使用空氣微流體生物制造對(duì)微室和大凝膠的尺寸、形?狀和各向同性控制
藻酸鹽水凝膠的尺寸和形狀以及它們所包含的中空隔室是??根據(jù)不同尺寸的微噴嘴在可移動(dòng)的 XYZ?平臺(tái)上的放置來(lái)控制??的。內(nèi)徑為 50?、100?、150?和 200?μm ?的微噴嘴產(chǎn)生的單分散? (CV?<?10%) ?隔室尺寸分別為 140 ?±?5?、219 ?±?14?、277 ?±12?和 347?±?18?μm（圖 2a?、b） ,這代表著對(duì)傳統(tǒng)高通量技術(shù)?（例如通常與組織尺寸的多分散性相關(guān)的大型生物反應(yīng)器）的?顯著改進(jìn)。 [28]
具有不同尺寸的隔室水凝膠，如 1D?纖維、2D?片材和 3D?體積，可以通過(guò)微噴嘴在多個(gè)維度上的移動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其理論??分辨率類似于隔室尺寸（140?±?5、219?±?14、277?±?12和 347?±?18） ,μm（對(duì)于內(nèi)徑分別為 50、100、150?和???200?μm?的核心噴射微噴嘴）。產(chǎn)生這些基本形狀的能力為??通過(guò)進(jìn)一步組裝這些形狀來(lái)制造更大的任意形狀的組織提供了?機(jī)會(huì)。 [53],隔室纖維是通過(guò)微噴嘴在單一維度上的移動(dòng)產(chǎn)生?的（圖2c?，d）。獨(dú)特的是，這創(chuàng)建了包含橢圓體隔室的水凝?膠纖維，其伸長(zhǎng)率為 1.7?+/-?0.5（圖 2e），其橢圓體形狀??始終遵循纖維的方向（圖 2f）。,這種隔室形狀控制提供了有?趣的可能性，因?yàn)楸娝苤谂囵B(yǎng)/生長(zhǎng)微組織的物理空間??中賦予伸長(zhǎng)率會(huì)導(dǎo)致一致且獨(dú)特的行為，從而指導(dǎo)其他形態(tài)發(fā)?生。?[54]
圖2。在空氣微流控生物制造中產(chǎn)生的一維、二維和三維區(qū)域化水凝膠中受控而獨(dú)特的形態(tài)。A)使用具有不同直徑的各種噴嘴制備的中空海藻酸鹽微膠囊的顯微照片，其有效地控制具有高單分散性(n?=?150)的水凝膠隔室的直徑 b)?。C)一維分隔光纖的亮場(chǎng)顯微照片。D)用葡聚糖 -FITC ?染綠的海藻酸鈉區(qū)室化纖維和用葡聚糖?-TRITC?染紅的區(qū)室的熒光共聚焦顯微照片。E)與其分隔的纖維(n?=?54)相比，隔室對(duì)齊的定量。F)一維?纖維中隔室的橢球延伸率與其隔室化水凝膠的三維體積相比(n?=?54)?。G)用于書寫和織造多室有效載荷(綠色葡聚糖 -FITC?和紅色葡聚糖 -TRITC )的區(qū)室化纖維的熒光共聚焦顯微照片。H)二維分區(qū)水凝膠片的亮場(chǎng)顯微照片。I)使用葡聚糖?-FITC?和使用 DextranTRITC?染色的紅色隔室的海??藻酸鹽染色的區(qū)室化片的熒光共聚焦?z?堆棧。J)單個(gè)切片(左)沿?xy?平面(頂部)和?x?平面(底部)劃分的平面的熒光強(qiáng)度直方圖，?以及作為構(gòu)建體??(右)的平均值。K)熒光共聚焦三維重建海藻酸鹽染色的單層分隔板.。
此外，如使用葡聚糖 -TRITC?(四甲基羅丹明異硫氰酸鹽)??和葡聚糖 -FITC?(異硫氰酸熒光素，圖2g)所示，通過(guò)利用2D??中的可移動(dòng)微噴嘴級(jí)，使用微隔室中的各種有效載荷可以用這?種生物制造技術(shù)形成多種材料寫作。此外，形成的纖維具有良?好的可操作性(例如，易于手工操作) ，這可能用于諸如編織??(圖2g) ，編織和編織等應(yīng)用，而不會(huì)不可避免地出現(xiàn)纖維故??障。?[55-58]據(jù)報(bào)道，對(duì)齊載細(xì)胞纖維的能力能夠改善組織工??程應(yīng)用，其中對(duì)齊是重要的，如肌肉組織工程應(yīng)用。此外，載?細(xì)胞的微纖維也被用于胰島細(xì)胞包封，利用植入患者體內(nèi)時(shí)纖?維的易回收性。?[55,62]
在一個(gè)維度上移動(dòng)微噴嘴產(chǎn)生水凝膠微纖維，二維運(yùn)動(dòng)允??許形成空間組織的單層水凝膠片(圖2h)。共聚焦 z 疊加分析??證實(shí)了印刷水凝膠片內(nèi)隔室的中空(例如，水性和非交聯(lián))性質(zhì)?(圖2i)。值得注意的是，形成的水凝膠擁有屬性具有對(duì)稱性和?各向異性的特性，這一點(diǎn)通過(guò)單個(gè)共焦切片的半定量直方圖分?析得到了證實(shí)(圖2j)。X 或 Y 平面的平均直方圖數(shù)據(jù)顯示隔??室的隨機(jī)放置，而 Z 平面顯示在特定高度的隔室放置方面是 ?一致的。諸如多層和多種材料的平面中的復(fù)雜性可以通過(guò)重復(fù)?平面形成的受控過(guò)程來(lái)增加，這導(dǎo)致由多層平面組成的水凝膠?,?其提供了以高度定義的方式使用多種材料或材料性質(zhì)的潛力?(圖2k，l)。二維載細(xì)胞片可以作為補(bǔ)丁起作用，?已經(jīng)證明其??在心臟組織工程應(yīng)用和傷口愈合補(bǔ)丁等方面是成功的[63-65]??,?并且可以卷起來(lái)模擬管狀結(jié)構(gòu)。?[66]
空氣印刷的退火微膠囊也被證明是容易地能夠迅速地產(chǎn)生??大量的3D 分區(qū)水凝膠(圖2m，n)。含有球體的3D 水凝膠已被 ?證明與廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)，例如，它一直被證明可以增?加軟骨形成和軟骨形成。?[10,12]雖然放置在二維分隔板中的??隔室具有可重復(fù)的各向異性，但三維體積的平均構(gòu)造直方圖顯?示三維體積是各向同性隔室放置的擁有屬性(圖2o，p)。填料??密度(隔室/容積)可以通過(guò)調(diào)整隔室尺寸來(lái)控制，方法是使用??不同內(nèi)徑的芯射流微噴嘴以及通過(guò)相對(duì)流量來(lái)控制。在與新噴?射艙碰撞時(shí)，沒(méi)有觀察到裝配結(jié)構(gòu)的動(dòng)力位移。
與傳統(tǒng)的0D?水凝膠隔室(如微膠囊)相比，1D?，2D?和3D?材?料的隔室化水凝膠的空氣中微流體生物制造提供了更高的可操?作性。具體而言，水凝膠微膠囊通常懸浮在液體中，因此必須?通過(guò)例如移液技術(shù)來(lái)處理，?由于粘附在培養(yǎng)塑料或移液管尖端?上，導(dǎo)致微粒容易丟失或物理?yè)p傷。相比之下，這里描述的
1D?纖維，2D?片材和3D?體積等較大的結(jié)構(gòu)可以使用鏟子和/????或鑷子等工具在宏觀層面上進(jìn)行處理，這些工具允許簡(jiǎn)單的復(fù)?雜操作，如書寫，編織或堆積單獨(dú)的材料，從而最大限度地減?少損失或損害。
2.3. 細(xì)胞負(fù)載的分隔水凝膠內(nèi)軟骨形成球體的超高通量生產(chǎn)
使用IAMF，可以以比傳統(tǒng)微流體高850倍以上的吞吐量生產(chǎn)?大型分隔水凝膠（傳統(tǒng)微流體為10?μLmin-1???[31]，而IAMF分?隔水凝膠為8.5 mL?min-1?）。這種方法可以用于以前所未有的?速度（10 000 個(gè)球體?s-1?）大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞球體。
為了證明這一點(diǎn)，C20A4軟骨細(xì)胞通過(guò)將細(xì)胞引入核心微射?流溶液(圖3a)被包裹在區(qū)室化的水凝膠中。在細(xì)胞負(fù)載的區(qū)室?化水凝膠形成后，立即用多余的培養(yǎng)基洗滌水凝膠，隨后提供?新鮮培養(yǎng)基。在24小時(shí)內(nèi)在水凝膠隔室內(nèi)形成的細(xì)胞球體能夠?在3D 水凝膠(圖3b)和1D 纖維(圖 S2，支持信息)內(nèi)在隔室內(nèi)??培養(yǎng)至少21天，其在至少21天的培養(yǎng)中保持穩(wěn)定。與噴嘴對(duì)照?相比，噴射時(shí)細(xì)胞活力保持高(95.6?± 2.8%?比95.6?± 0.5)?(圖3c，d) ，這是可以預(yù)期的，因?yàn)闈撛诘挠泻羟辛χ饕?液體的粘度決定，在本研究中是非常低的。細(xì)胞活力在隨后的?細(xì)胞培養(yǎng)中保持高水平(96?± 3%)(圖3c，d)包封的細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)調(diào)節(jié)核心微噴溶液中的細(xì)胞濃度來(lái)??控制，在核心微噴溶液中分別為每隔室13?± 5,38?± 10和73±?15個(gè)細(xì)胞，分別為2?×?106,5?×?106和107個(gè)細(xì)胞 mL-1 (圖S3，支持信息)。形成的細(xì)胞球體具有單分散的尺寸分布(第1?天 CV?≤10%)?，這表明在?IAMF?產(chǎn)生的區(qū)室化水凝膠內(nèi)控制??細(xì)胞球體的形成(圖3e，f)。
圖3。在空氣中生物打印區(qū)室化水凝膠中原位形成球體。A)區(qū)室化水凝膠內(nèi)球體形成示意圖。B)第0天，第1天和第21天包裹的軟骨細(xì)胞的亮場(chǎng)顯?微照片。C)在第0天(頂部)和第7天(底部)用活細(xì)胞染色的活力染色的熒光顯微照片使用鈣黃綠素 -AM?染色綠色，使用同型二聚體乙錠染色紅色??的死細(xì)胞。D)在區(qū)室化水凝膠(n?=?136個(gè)球體)中培養(yǎng)0,1和7天后活的軟骨細(xì)胞部分的定量。E)在間隔化水凝膠(n?=?100)中培養(yǎng)21天以上的球體??直徑的定量。F)使用4’，6-二脒基 -2-苯基吲哚(DAPI)和使用?Alexa??Fluor?488鬼筆環(huán)肽在分隔的水凝膠中培養(yǎng)21天后使用 F-?肌動(dòng)蛋白染色的藍(lán)色?核球體的共聚焦熒光顯微照片。G)軟骨形成標(biāo)志物 g)?SOX9?，h)?ACAN?和 i)?COL2A1和纖維軟骨標(biāo)志物?j)?COL1的相對(duì) mRNA?水平，?以及COL2A1和 COL1之間的 k)相對(duì)比率作為來(lái)自人原代軟骨細(xì)胞的軟骨表型的指示培養(yǎng)為單層或球體在區(qū)室化水凝膠中21天(每個(gè) n?=?2,50000個(gè)球?體)。使用)?dAPI??(藍(lán)色) ?，膠原蛋白2(綠色) ?，聚集蛋白聚糖(紅色)和 m)?dAPI??(藍(lán)色) ?，膠原蛋白1(綠色)和透明質(zhì)酸合酶1(HAS1)(紅色)的免疫?熒光染色在軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后可視化在分隔的水凝膠中形成的細(xì)胞球體的熒光顯微照片。比例尺等于50微米。數(shù)據(jù)以平均值 ±?SD?表示??。P?<?0.05的顯著性由 *?表示。
使用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染紅的隔室。L)熒光共聚焦3D?重建具有多室有效載荷(綠色葡聚糖 -FITC?和紅色葡聚糖 -TRITC)的雙層?區(qū)室化平面。M)三維分區(qū)水凝膠體積的亮場(chǎng)顯微照片。N)使用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染色的紅色隔室的區(qū)室化體積與海藻酸鹽染?色綠色的熒光共聚焦?z?堆棧。O)單個(gè)切片(左)沿?xy?平面(頂部)和?x?平面(底部)分隔體積的熒光強(qiáng)度直方圖，并作為構(gòu)建體(右)的平均值。P)使?用葡聚糖 -FITC?和使用葡聚糖 -TRITC?染色的紅色隔室，用海藻酸鹽染色的單層區(qū)室化水凝膠體積的熒光共聚焦3D?重建。比例尺等于500微米?。數(shù)據(jù)以平均值 ±?SD?表示。
控制被包裹細(xì)胞數(shù)量的能力以及由此形成的球體直徑尤其??重要，因?yàn)榍蝮w直徑已知會(huì)影響生物學(xué)功能。?[12]以前的研究?報(bào)道，與單個(gè)細(xì)胞和較大的球體相比，通過(guò)增加 SOX9，ACAN ?和 COL2A1的表達(dá)，同時(shí)降低 COL1的表達(dá)，每個(gè)球體產(chǎn)生50-1???00個(gè)細(xì)胞，從而改善成軟骨性能。因此，?以107個(gè)細(xì)胞 mL-1包??裹原代人軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨形成實(shí)驗(yàn)，其相當(dāng)于每個(gè)隔室73±?15個(gè)細(xì)胞。
原代人軟骨細(xì)胞在分區(qū)水凝膠中形成球體或在成軟骨培養(yǎng)??基中作為單層培養(yǎng)21天。與單層相比，區(qū)室化水凝膠中的軟骨?細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的軟骨形成母轉(zhuǎn)錄因子 SOX9(圖3g)以??及關(guān)鍵軟骨細(xì)胞外間質(zhì)組分 ACAN?(圖3h)和 COL2A1(圖3i)?，?同時(shí)表達(dá)較低水平的不需要的纖維軟骨標(biāo)志物 COL1(圖3j)和??較高的 COL2A1/COL1比率在細(xì)胞球體中與單層培養(yǎng)物相比(圖??3k)。結(jié)合起來(lái)，基因表達(dá)譜證實(shí)了在中空區(qū)室化水凝膠內(nèi)自??主形成的細(xì)胞微球確實(shí)與比單獨(dú)分散在整個(gè)固體水凝膠中的細(xì)?胞更強(qiáng)的成軟骨表型相關(guān)聯(lián)。為了確認(rèn)在區(qū)室化水凝膠中球體?是否發(fā)生了真正的成軟骨行為，對(duì)暴露于成軟骨分化培養(yǎng)基21?天的球體進(jìn)行了免疫熒光染色。事實(shí)上，區(qū)室化水凝膠中的球?體表達(dá)軟骨標(biāo)志物，如膠原蛋白1，膠原蛋白2，聚集蛋白聚糖?和透明質(zhì)酸合成酶1(圖31，m)。這些結(jié)果表明，在區(qū)室化的水?凝膠中自主形成的球體，在類似于傳統(tǒng)的低通量產(chǎn)生的球體的?軟骨形成性能方面優(yōu)于傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)物[9] ，現(xiàn)在可以考慮?用于軟骨工程，特別是作為一種新的方法，?以清潔，細(xì)胞相容?,?單步和臨床可伸縮的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞球體的益處的臨床翻譯。
2.4. 在空氣中微流控球形成區(qū)室化水凝膠允許形狀穩(wěn)定的臨?床尺寸的無(wú)生物材料細(xì)胞組織的形成組織形成。然而，球體培養(yǎng)也被發(fā)現(xiàn)有利于工程無(wú)生物材??料的活組織的形式自下而上的組織工程利用球體作為模塊化的?建設(shè)模塊。與傳統(tǒng)的單細(xì)胞技術(shù)相比，細(xì)胞球體允許生產(chǎn)更多?的形狀穩(wěn)定的組織。這種嚴(yán)格的形狀和體積控制在可預(yù)測(cè)的組?織工程和適形缺損填充中非常重要，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)收縮的開始將不?可避免地導(dǎo)致不想要的缺陷和空洞的形成。不幸的是，?由于現(xiàn)?有的球體批量生產(chǎn)過(guò)程，這些臨床尺寸的構(gòu)建體仍然無(wú)法達(dá)到?,?因?yàn)樾枰罅康那蝮w來(lái)形成大規(guī)模的組織構(gòu)建體?; 傳統(tǒng)的球?體生產(chǎn)過(guò)程只提供低生產(chǎn)率。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們假設(shè)區(qū)?室化的水凝膠可以被犧牲，因此作為臨時(shí)和可自由選擇的3D微反應(yīng)器來(lái)促進(jìn)單分散細(xì)胞球體的大規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)際上，擴(kuò)展?到第三維度將顯著提高球體生產(chǎn)率，因?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)平臺(tái)的本?質(zhì)都是二維的。我們推斷，區(qū)室化水凝膠的超高通量球體生產(chǎn)?性質(zhì)將能夠生產(chǎn)形狀穩(wěn)定，臨床大小的無(wú)生物材料的細(xì)胞組織?(圖4a)。
為了產(chǎn)生只有315?μL 體積的完整細(xì)胞組織所需的球體數(shù)量?,?這估計(jì)常見的全厚度軟骨缺陷為1.5 cm2 [68]?，將需要總共?150個(gè)12孔板的單個(gè)孔(每孔3600個(gè)球體[9])(圖4b)。因此，訓(xùn)?練有素的手工勞動(dòng)的數(shù)量被認(rèn)為是不可擴(kuò)展的，因此挑戰(zhàn)廣泛?的臨床翻譯球體為基礎(chǔ)的細(xì)胞組織。然而，利用連續(xù)的 IAMF??分區(qū)水凝膠方法，只需要60秒的運(yùn)行時(shí)間就可以產(chǎn)生相同數(shù)量?的球體(圖4b)。值得注意的是，特定的醫(yī)療應(yīng)用需要更大的組?織尺寸才能被認(rèn)為是臨床尺寸，這可以通過(guò)將生產(chǎn)運(yùn)行時(shí)間從?一分鐘延長(zhǎng)到幾分鐘來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)。預(yù)計(jì)將多個(gè)連續(xù)的工匠批處?理過(guò)程演變?yōu)閱蝹€(gè)連續(xù)的亞分鐘運(yùn)行時(shí)過(guò)程，?以促進(jìn)使用細(xì)胞?球體構(gòu)建塊自底向上工程大型組織的可行性。此外，我們的新?方法也更加生態(tài)友好，因?yàn)樗蟠鬁p少了塑料板需要?jiǎng)?chuàng)建這種?自下而上的方法大型活組織的數(shù)量。軟骨細(xì)胞球體在海藻酸鈉隔離的水凝膠中大量生產(chǎn)，并培?養(yǎng)4天后使用海藻酸鈉裂解酶洗滌步驟酶促回收(圖4c)。
圖4。分區(qū)水凝膠作為臨床尺寸細(xì)胞組織工程球體生產(chǎn)的3D?平臺(tái)。A)臨床大小的細(xì)胞組織形成示意圖，包括在區(qū)室化水凝膠中的高通量(HT)球?體生產(chǎn)，從區(qū)室化水凝膠中檢索球體，瓊脂糖模型中的球體注射制模，?以及隨后的組織形成。B)需要與空氣微流體運(yùn)行時(shí)相比的微孔的理論表示需要?jiǎng)?chuàng)建 ±?540000個(gè)球體，這是填充模型注射模具所需的。C)海藻酸裂解酶處理后回收的軟骨細(xì)胞球體的亮場(chǎng)顯微照片。D)在培養(yǎng)24小時(shí)后?,?在12孔板中的瓊脂糖霉菌中形成的厘米大小的組織的照片。E)培養(yǎng)24小時(shí)后形成的組織的縫合顯微照片。F)在原始模具形狀輪廓的頂部，用??球體(頂部)或單個(gè)細(xì)胞(底部)投影形成的組織。G)由球體或單個(gè)細(xì)胞形成的組織的組織投影面積相對(duì)于霉菌的投影面積(n?=?4)?。H)已形成的組??織與球體或單個(gè)細(xì)胞相對(duì)于霉菌形狀的重疊(針對(duì)組織投影區(qū)域校正)(n?=?4)?。I)由球體(頂部)或單個(gè)細(xì)胞(底部)產(chǎn)生的已形成組織的投影，?以紅??色表示角度，?以白色表示測(cè)量角度(n?=?4)?。J)培養(yǎng)后軟骨細(xì)胞的細(xì)胞體積和在分區(qū)水凝膠內(nèi)形成的球體在0(對(duì)照) ?，1和4天的培養(yǎng)(n?=?500)。數(shù)據(jù)以平均值 ±?SD?表示。P?<?0.05的顯著性由 *?表示。
由于海藻酸裂解酶的生物相容性和正交性[69]以及溫和的洗滌??過(guò)程，沒(méi)有觀察到球體形態(tài)的變化。值得注意的是，這種細(xì)胞?球體的檢索方法與其他常用的球體形成平臺(tái)(例如從微孔中回??收的球體的強(qiáng)力流體動(dòng)力學(xué)攪動(dòng))相比，提供了明顯更溫和的??條件的優(yōu)勢(shì)。將大約540000個(gè)球體或等量(4??×?107)的單個(gè)細(xì)胞?注射到厘米大小的骨形模具中以形成厘米大小的工程組織。選?擇骨的符號(hào)形狀是因?yàn)樗m合于評(píng)估形成的組織的形狀穩(wěn)定性?(圖4d?，e)。我們觀察到，與單個(gè)細(xì)胞相比，利用球狀注射制???模進(jìn)行大規(guī)模組織切割可以獲得更好的形狀穩(wěn)定性(圖4f)。具??體而言，如組織投射面積所示，大規(guī)模生產(chǎn)的球體與較低的組?織收縮相關(guān)，在單天培養(yǎng)后，球體為71.7?±?7.3% ?，單個(gè)細(xì)胞??為47.5?±?0.4%?(圖4g)。
此外，當(dāng)接種球體(90.3?±?0.2%)時(shí)，生產(chǎn)的組織與注射模具的?形狀顯示出更高的重疊，而當(dāng)使用單細(xì)胞(84.0?±?0.1%)時(shí)(圖??4h)。這一觀察結(jié)果得到了完全細(xì)胞狀骨組織物理末端角度的??測(cè)量結(jié)果的證實(shí)。球體的骨形組織(122?±?14?。)的曲線保持與??所用注射模具(116?±?2?。)的高保真度，而使用單細(xì)胞懸浮液(176?±?19?。)時(shí)角度幾乎喪失(圖4i)。我們推斷，在三維微組織?形成過(guò)程中發(fā)生的凝聚階段的細(xì)胞收縮可能為觀察到的工程化?大細(xì)胞組織形狀穩(wěn)定性的差異提供了解釋。細(xì)胞體積分析顯示?,?將來(lái)自2D?環(huán)境的細(xì)胞置于3D?環(huán)境中導(dǎo)致單日培養(yǎng)后細(xì)胞??體積從6.0?±?2.7降至4.4?±?2.3?pL?(圖4j)。此外，細(xì)胞體積在進(jìn)?一步的3D?培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定(5.0?±?2.1?pL)。這表明，區(qū)室??化水凝膠中最初的球體形成創(chuàng)造了微組織構(gòu)件，這些構(gòu)件與來(lái)自2D?培養(yǎng)物的單個(gè)細(xì)胞不同，在用于工程大細(xì)胞組織時(shí)不會(huì)??收縮，因此在用于活組織的注射模具工程時(shí)提供了更好的形狀?穩(wěn)定性。
IAMF?允許成功生產(chǎn)細(xì)胞負(fù)載的空心分區(qū)水凝膠，使原位??形成細(xì)胞球體在超高通量，清潔，單一步驟的方式。這種創(chuàng)新?技術(shù)被證明與傳統(tǒng)的噴墨生物打印技術(shù)兼容，這種技術(shù)促進(jìn)了?具有多種復(fù)雜性的分區(qū)水凝膠的生產(chǎn)，而手持噴墨生物打印允?許快速和容易的分區(qū)球體形成水凝膠的自由生物制造。利用IAMF??的超高通量，在相關(guān)的時(shí)間框架內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基于球體的臨?床尺寸軟骨組織的可擴(kuò)展生產(chǎn)，這代表了細(xì)胞球體臨床翻譯的?重要一步。
IAMF 設(shè)置: 用于區(qū)室化水凝膠的 IAMF 設(shè)置由兩個(gè)相似噴??嘴直徑的錐形噴嘴(Idex Health & Science)組成，定位角度??為?± 40?° ,?使用微米精度 XYZ?級(jí)(Thorlab)對(duì)準(zhǔn)。噴嘴連?接到魯爾鎖定玻璃注射器(漢密爾頓)與氟化乙烯丙烯(FEP)管??(ID250?μm，杜邦公司)。流量由低壓注射泵(neMESYS，Cetoni?)控制。主噴嘴連接到一個(gè)壓電驅(qū)動(dòng)器，該驅(qū)動(dòng)器以5Vpp 的頻?率工作，頻率在1至10kHz 之間，這取決于所使用的噴嘴直徑??,?從而可以控制微噴的破碎。二次噴嘴的排列使其微射流與一?次微射流的單分散液滴序列相結(jié)合。使用高速顯微鏡照相機(jī)(SMZ800N，附有 uEye usb 照相機(jī)的尼康，IDS)證實(shí)了微噴與?液滴列車的受控液滴破碎和合并。
海藻酸鈉分區(qū)水凝膠的制備和分析: 主要微噴由10% w/v葡聚糖(40kDa，Pharmosmos)和50?× 10-3m?氯化鈣(CaCl 2)??(Sigma-Aldrich)組成。在?dH2O 中，二次微噴由0.5% w/v 海?藻酸鈉(80-120cP，F(xiàn)UJIFILM Wako)和10% v/v 乙醇(EtOH)組??成。使用不同的噴嘴直徑(50,100,150和200μm)來(lái)制造不同艙?室尺寸的艙室。對(duì)于直徑為50?μm?的噴嘴，驅(qū)動(dòng)器頻率為6.5??kHz 的一次和二次微噴分別采用0.9和1.1 mL min-1的流量。
對(duì)于100?μm 直徑的噴嘴，分別使用2和2.2 mL min-1的流量對(duì)?于具有5.5 kHz 的驅(qū)動(dòng)器頻率的一次和二次微噴射，或者分別?使用4和4.5 mL min-1的流量對(duì)于一次和二次微噴射，如果表??明總流量為8.5 mL min-1，驅(qū)動(dòng)器頻率為5.5 kHz。對(duì)于直徑??為150?μm?的噴嘴，驅(qū)動(dòng)器頻率為4.5 kHz 的一次和二次微噴??分別采用3和3.2 mL min-1的流量。對(duì)于直徑為200?μm?的噴嘴?,?驅(qū)動(dòng)器頻率為3.5 kHz 的一次和二次微噴分別采用4和4.2mL min-1的流量。微射流的擁有屬性為 We?± 25，碰撞角度?為?± 40?°?,?相當(dāng)于 We?Impact?±?10。
使用多種制備方法生產(chǎn)分區(qū)水凝膠。對(duì)于第一種選擇，將噴嘴固?定在位置上，并將空氣形成的隔室收集在可移動(dòng)?XZ?收集臺(tái)上的培養(yǎng)皿中，用于生產(chǎn)隔離的水凝膠。對(duì)于第二種選擇，將噴嘴固定在3D 打?印機(jī)(Inkredible?+?，CELLINK)?的可移動(dòng)打印頭(1m?s-1)上，并將空氣形成?的隔室收集在培養(yǎng)皿中以生產(chǎn)隔離的水凝膠。對(duì)于第三種選擇，將噴??嘴固定在手持設(shè)備上，允許手動(dòng)沉積空氣形成的隔室，用于生產(chǎn)隔離??的水凝膠。無(wú)論使用哪種裝置，都可以通過(guò)控制噴嘴或收集培養(yǎng)皿的??運(yùn)動(dòng)來(lái)生產(chǎn)一維纖維、二維平面和三維體積的分隔水凝膠。
使用明場(chǎng)顯微鏡(EVOS?FL?成像系統(tǒng)，ThermoFisher)觀察劃分的水凝?膠。間隔直徑用?Feret?直徑測(cè)量。通過(guò)將0.5?mg?mL-12000?kDa?葡聚糖?–??TRITC?(Sigma-Aldrich)添加到一次微噴中和0.5?mg?mL-12000?kDa?葡聚糖?–?FITC?(Sigma-Aldrich)添加到含有二次微噴的海藻酸鹽中來(lái)研究隔室的中?空性質(zhì)。熒光標(biāo)記的區(qū)室化水凝膠分析使用共聚焦?z?疊加顯微鏡分析??(尼康?A1共聚焦)。利用?ImageJ?軟件對(duì)粒度分布、單分散性、角度取向?、橢球伸長(zhǎng)率和熒光強(qiáng)度進(jìn)行了分析。
細(xì)胞培養(yǎng): 將?C20A4軟骨細(xì)胞(人軟骨細(xì)胞系，Sigma?Aldrich，SCC041)在含有10% 胎牛血清(FBS?，SigmaAldrich)?，100U?mL-1青霉素?(Gibco)和100μgmL-1鏈霉素(Gibco)的?Dulbecco?改良的?Eagle?培養(yǎng)基(DMEM?，Gibco)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每?jī)芍芨鼡Q一次。將人軟骨細(xì)胞在含??有?DMEM?，10%?FBS?，100U?mL-1青霉素，100μgmL-1鏈霉素，0.1 ×?10-??3mL?脯氨酸(SigmaAldrich)的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng),1% 非必需氨基酸(NEAA?,?Sigma-Aldrich)和1% 抗壞血酸(ASAP?，Sigma-Aldrich)或在含有?DMEM ??,?100U?mL-1青霉素，100μg?mL-1鏈霉素的軟骨培養(yǎng)基中,0.1 ×?10-3mL-??脯氨酸(Sigma-Aldrich)?，1%?非必需氨基酸(NEAA?，SigmaAldrich)和1%?????抗壞血酸(ASAP?，Sigma-Aldrich)?，10ng?mL-1TGFb3(R &?D?系統(tǒng))和0.1 ×????10-6m 地塞米松(Sigma-Aldrich)。達(dá)到80%?融合時(shí)，細(xì)胞傳代。
細(xì)胞培養(yǎng)物保存在37 °C，含5% CO2的潮濕環(huán)境中。細(xì)胞包裹:?當(dāng)制?備細(xì)胞負(fù)載的區(qū)室化水凝膠時(shí)，微射流溶液中的?dH2O 被無(wú)磷酸鹽(Gibco)的?DMEM?所取代。使用胰島素乙二胺四乙酸(Invitrogen)分離細(xì)?胞，用培養(yǎng)基洗滌，隨后通過(guò)40μm 細(xì)胞過(guò)濾器(EASYstrainer?，Greiner ?)以確保單細(xì)胞懸浮。除非另有說(shuō)明，然后將細(xì)胞懸浮于初級(jí)微噴溶液?中的107細(xì)胞?mL-1。然后將載有細(xì)胞的溶液裝入并保存在冰冷的氣密??注射器中，持續(xù)封裝過(guò)程(<?10分鐘)。在細(xì)胞封裝實(shí)驗(yàn)中，噴嘴直徑為?100μm?，一次和二次微噴的流量分別為2和2.2?mL?min-1，壓電致動(dòng)器??的頻率為5.5?kHz。載細(xì)胞的區(qū)室化水凝膠收集在培養(yǎng)皿中或直接進(jìn)入?培養(yǎng)板。生產(chǎn)完成后，立即用培養(yǎng)基清洗分隔的水凝膠，?以洗去多余?的乙醇，維持高細(xì)胞活力。最后，加入新鮮培養(yǎng)基，將分離的水凝膠?置于培養(yǎng)基中。
通過(guò)明場(chǎng)顯微鏡(EVOS?FL?成像系統(tǒng)，ThermoFisher)監(jiān)測(cè)細(xì)胞包裹后?的細(xì)胞聚集。根據(jù)制造商的方案(Invitrogen)?，通過(guò)用鈣黃綠素?AM?和??乙錠同源二聚體?-1染色研究細(xì)胞活力，并使用數(shù)字熒光顯微鏡(EVOS ????FL?image?System?，ThermoFisher)進(jìn)行成像。
對(duì)于額外的分析，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌載有細(xì)胞的區(qū)室化??水凝膠，并使用10% 緩沖福爾馬林溶液(Sigma-Aldrich)固定。使用0.1%?Triton?X-100(Sigma-Aldrich)使細(xì)胞透化，隨后用2.5?U?mL-1鬼筆環(huán)肽?-F488(Thermo?Fisher?Scientific)和10μgmL-1DAPI?(Thermo?Fisher?Scientific )分別染色?F- 肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核。熒光染色的樣本分析使用共聚焦顯??微鏡(尼康共焦?A1)和?ImageJ?軟件。
基因表達(dá)分析: 將原代人軟骨細(xì)胞包裹在分區(qū)水凝膠中，在成軟骨?細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天。作為對(duì)照，原代人軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)。用TRIzol?(Invitrogen)裂解緩沖液制備用于即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)分析?的樣本，并按照供應(yīng)商提供的方案，使用?miRNeasy?試劑盒(QIAGEN)進(jìn)?行?RNA?分離。使用?iScript?cDNA?合成試劑盒(Bio-Rad)合成?cDNA。然后??,?在?CFX?Connect?實(shí)時(shí)系統(tǒng)(BioRad)上使用?SensMix?SYBR?和熒光素試劑?盒(Bioline)對(duì)?cDNA?進(jìn)行?qPCR。
軟骨生產(chǎn)分析: 將原代人軟骨細(xì)胞包裹在分區(qū)水凝膠中，在成軟骨??培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天。使用10% 緩沖福爾馬林溶液固定球體，使用0.1%???Triton-X?(Sigma-Aldrich)透化，使用10%?牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)封??閉，并使用1:100抗膠原蛋白1(Novus?生物學(xué))染色,1:100抗膠原2(Abcam )?，1:100抗聚集蛋白聚糖(Abcam)或1:200抗透明質(zhì)酸合酶1(Abcam)與1:??250 AF488(Invitrogen)和1:200AF647(Abcam)標(biāo)記的二抗和1:100?DAPI?作?為計(jì)數(shù)染色。
大細(xì)胞組織形成: 將?C20A4細(xì)胞包裹在區(qū)室化的水凝膠中并培養(yǎng)四???天，在此基礎(chǔ)上通過(guò)?PBS?洗滌和10U?mL-1海藻酸裂解酶(Sigma-Aldrich)??在37 °C 溫育30分鐘來(lái)回收細(xì)胞球體。將大約54萬(wàn)個(gè)球體(± 4 ×?107個(gè)細(xì)?胞)注射到瓊脂糖骨狀霉菌中，形成一個(gè)大的細(xì)胞組織。以4 ×?107單個(gè)?細(xì)胞為對(duì)照，注射入骨霉菌中。可以注射細(xì)胞的霉菌總體積為315μL?????,?如前所述生產(chǎn)。[70]使用前將瓊脂糖模型在培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)。
使用宏觀攝影(佳能?EOS?6D)和明場(chǎng)顯微鏡(EVOS?FL?成像系統(tǒng)，ThermoFisher)分析形成的大型組織。對(duì)培養(yǎng)0,1,4天的球體進(jìn)行胰蛋白?酶消化，通過(guò)亮場(chǎng)成像分析細(xì)胞大小/體積。使用ImageJ?軟件分析大?的組織表面積、形狀和細(xì)胞體積。
統(tǒng)計(jì)分析: 數(shù)據(jù)以平均值± SD?表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的樣本量在圖形描述??中報(bào)告。通過(guò)單因素方差分析確定顯著性。用?* 表示?p < 0.05的顯著性?。所有統(tǒng)計(jì)分析均在?OriginPro2017中進(jìn)行。
關(guān)鍵詞
聚集體，生物制造，細(xì)胞包裹，隔離水凝膠，空氣中微流體，?微流體，球體
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